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如何在RT-PCR過程中避免DNA污染?

更新時間：2020-07-02 點擊次數：3244

如何在RT-PCR過程中避免DNA污染？用arcticzymes公司Heat＆Run gDNA去除試劑盒

PCR主混合物的去污

PCR是在研究和診斷中檢測DNA存在的靈敏方法。PCR中使用的聚合酶經常被大腸桿菌 DNA 污染。當靶向少量細菌DNA時，污染的DNA可能會導致靈敏度降低和假陽性。其他污染源可能是dNTP，緩沖液成分和引物/探針，以及在處理過程中引入的DNA。細菌的檢測和分型可以通過使用針對保守區域（即16S或23S rDNA基因）的寬范圍引物進行。該方法對細菌DNA污染非常敏感，在大多數預混液和聚合酶中都可以發現細菌DNA的痕跡。當使用qPCR檢測或定量少量細菌DNA時，會污染 大腸桿菌 DNA可能導致假陽性結果。

Master mix AMaster mix BMaster mix CMaster mix DMaster mix EMaster mix F5101520253035404501,0002,0003,0004,0005,0006,000CyclesFluorescence (dR)

周期數	預混料A	預混料B	預混料C	預混料D	預混料E	預混料F
1個	445.82	188.53	262.32	24.54	119.24	19.88
2	280.95	98.89	146.05	16.96	74.5	17.48
3	138.57	38.05	67.71	9.91	41.73	13.14
4	45.34	8.98	39.43	6.54	24.71	8.17
5	18.42	5.01	30.5	4.27	13.97	3.47
6	17.27	10.14	3.86	2.53	3.71	1.59
7	18.37	19.65	-13.69	1.3	-0.5	1.9
8	6.23	8.45	-14.54	-3.12	1.07	1.33
9	16.91	-10.83	1.59	-5.19	0.84	-1.22
10	27.13	-3.87	13.88	-6	-1.59	-5.54
11	15.27	2.74	17.72	-6.45	-4.11	-7.13
12	-9.27	11.16	7.09	-7.32	-4.19	-6.29
13	-23.72	15.34	-11.46	-7.05	-4.52	-6.29
14	-10.8	12.94	-18.65	-6.1	-4.63	-5.85
15	-11.42	-3.06	-18.21	-7.25	-4.49	-5.47
16	-9.14	-2.26	-14.4	-6.37	-6.29	-5.86
17	-11.23	2.29	-4.63	-6.29	-8.56	-7.84
18歲	-22.43	-2.06	11.46	-7.32	-10.91	-9.5
19	-37.18	2.12	1.48	-7.2	-12.59	-7.35
20	-42.19	3.56	-7.84	-6.83	-12.98	-7.59
21	-25.13	13.75	-6.62	-6.92	-12.16	-10.05
22	-10.7	8.27	-4.96	-6.11	-9.45	-9.58
23	-9.07	-1.34	12.42	0.75	-5.03	-9.3
24	-6.71	16.25	7.88	14.34	-2.95	-8.86
25	3.73	26.74	-12.22	38.92	-0.3	-4.95
26	21.95	16.12	-1.17	92.59	11.75	4.8
27	44.51	10.79	0.93	197.62	38.32	25.43
28	65.1	2.72	15.04	391.52	90.41	64.57
29	120.95	5.33	39.24	740.71	190.44	139.16
30	241.81	35.16	84.47	1,314.08	373.74	282.38
31	475.25	79.48	221.05	2,117.01	692.8	548.3
32	848.63	172.21	438.41	3,012.37	1,210.32	1,003.21
33	1,381.49	309.17	777.19	3,775.06	1,900.63	1,694.92
34	2,049.27	480.45	1,272.03	4,315.72	2,748.62	2,537.76
35	2,738.02	719.59	1,815.39	4,682.25	3,707.58	3,344.92
36	3,348.5	986.26	2,392.68	4,928.08	4,495.48	3,977.28
37	3,871.24	1,266.95	2,996.86	5,092.26	4,951.86	4,429.49
38	4,310.55	1,593.89	3,511.08	5,205.38	5,185.25	4,767.34
39	4,643.89	1,889.91	3,973.82	5,294.18	5,319.67	5,021.63
40	4,918.33	2,125.13	4,400.73	5,362.6	5,409.15	5,215.4
41	5,130.29	2,332.17	4,715.53	5,408.24	5,468.26	5,367.39
42	5,273.35	2,475.56	4,963.13	5,441.55	5,511.18	5,483.24
43	5,407.78	2,588.48	5,143.08	5,469.56	5,548.48	5,569.71
44	5,539.07	2,710.59	5,254.89	5,484.62	5,577.68	5,636.28
45	5,662.91	2,832.27	5,377	5,495.64	5,602.42	5,699.93

圖1：通過使用水代替模板（NTC）并按照制造商的說明對來自不同供應商的2x探針預混合物中大腸桿菌23S DNA的存在進行了定量。該圖顯示了來自幾個單獨實驗的圖。在所有測試的預混物中都發現了痕量的大腸桿菌23S DNA，Cq值通常在30-35之間。

為了解決這個問題，我們開發了一種簡單而又準確的 PCR去污試劑盒，該試劑盒可去除主混合物中的污染DNA，而不會降低PCR靈敏度

PCR Decontamination Kit

PCR去污試劑盒

PCR去污試劑盒可去除PCR預混液中的污染DNA，而不會降低PCR靈敏度。

dsDNase的雙鏈特異特性允許使用引物和探針進行去污染。
高效用于終點PCR和基于探針的qPCR。
污染的細菌DNA降至檢測極限以下的水平。
快速簡便的協議。

在不降低靈敏度的情況下對母料進行去污一直是一個挑戰。尤其是當靶向少量DNA時，污染DNA是一個主要問題。由去污方案在qPCR分析中造成的任何靈敏度損失都是不可接受的。

協議

將引物和探針與主要混合物和試劑盒內容混合
在37°C下孵育20分鐘
在60°C下失活20分鐘
添加模板并運行qPCR

在存在DTT的情況下，dsDNase在60°C時不可逆地失活，從而確保失活后添加的任何模板都對消化沒有影響。

用于從20 µl反應中去除污染性DNA的方案，但可以通過調整試劑盒內容物的體積來按比例放大或縮小。

圖1： PCR去污試劑盒方案

500 pg untreated50 pg untreated5 pg untreated500 fg untreated50 fg untreatedNTC untreated500 pg decontaminated50 pg decontaminated5 pg decontaminated500 fg decontaminated50 fg decontaminatedNTC decontaminated5101520253035404502,5005,0007,50010,00012,50015,000Cycles

周期數	500 pg未經處理	50 pg未經處理	5 pg未經處理	500 fg未經處理	50 fg未經處理	未經處理的NTC	500 pg消毒	50 pg消毒	5 pg消毒	500 fg消毒	50 fg消毒	NTC凈化
1個	-217	-38	-13	-63	-12	-7	-133	13	-10	13	17	21
2	-107	-22	2	-36	-9	-22	-55	14	-11	-3	8	-10
3	-69	-10	-1	-23	-20	-26	-27	10	-1	-12	12	-39
4	-46	-1	2	-12	-20	-14	-13		6	-6	8	-44
5	-29	7	4	3	-7	-4	-4	-2	5	5	4	-63
6	-11	9	6	8	11	1個	5	1個	-6	9	4	-63
7	6	5	11		12	9	15	2	-4	11	-7	-44
8	12	-3	12	6	-7	13	6	8	11	12	1個	-29
9	3	-17	3	14	-4	12	-13	9	14	-5	8	-12
10	-15	-16	-7	14	6	6	-8	-5	9	-4	1個	5
11	-22	2	-9	5	2	4	-1	-9	9	7	6	20
12	-21	3	-5	-2	-3	13	-10	3	8	14	5	14
13	-2	-11	-4	2	2	2	-5	-2	-3	14	-2	11
14	34	-4	-5	-13	12	1個	16	-12	-7		-9	22
15	89		-3	-16	8	7	60	-3	2	-9	-5	19
16	204	1個	-20	-9	-1	3	162	2	-15	-22	-10	25
17	416	20	-31	-9	-10	4	371	11	-33	-24	-17	35
18歲	764	70	-16	-12	-5	-1	746	57	-26	-14	-17	29
19	1,297	173	1個	-22	-7	-6	1,310	154	-16	-1	-22	21
20	2,015	347	15	-21	-25	-10	2,049	344	8	2	-15	13
21	2,886	644	46	-20	-27	-16	2,915	657	51	-8	-1	5
22	3,865	1,115	122	-7	-27	-28	3,879	1,122	127	-7	5	8
23	4,879	1,774	261	10	-33	-32	4,908	1,764	270	4	-2	20
24	5,919	2,597	508	35	-24	-21	5,927	2,576	527	34	-20	26
25	6,951	3,525	921	101	-2	-22	6,892	3,514	960	94	-22	25
26	7,930	4,526	1,520	221	14	-13	7,855	4,505	1,587	209	3	10
27	8,818	5,526	2,301	426	37	-5	8,771	5,495	2,406	434	36	8
28	9,628	6,511	3,242	778	99	2	9,570	6,473	3,357	808	93	11
29	10,380	7,472	4,278	1,337	192	9	10,291	7,422	4,384	1,375	199	5
30	11,037	8,371	5,346	2,101	382	43	10,940	8,306	5,445	2,146	393	6
31	11,646	9,210	6,400	3,047	721	101	11,524	9,096	6,489	3,097	727	4
32	12,184	9,985	7,417	4,132	1,229	182	12,042	9,814	7,496	4,149	1,261	-15
33	12,627	10,694	8,402	5,274	1,980	344	12,482	10,482	8,465	5,254	2,018	-24
34	13,001	11,317	9,291	6,409	2,945	586	12,836	11,075	9,387	6,393	2,961	-6
35	13,334	11,858	10,101	7,498	4,071	944	13,113	11,616	10,200	7,492	4,066	3
36	13,631	12,329	10,847	8,566	5,276	1,444	13,356	12,072	10,902	8,520	5,231	6
37	13,878	12,740	11,522	9,594	6,482	2,088	13,547	12,442	11,541	9,482	6,415	9
38	14,080	13,064	12,091	10,509	7,694	2,871	13,718	12,785	12,097	10,364	7,582	-11
39	14,235	13,341	12,562	11,364	8,880	3,793	13,876	13,064	12,576	11,178	8,696	-27
40	14,347	13,580	12,977	12,111	9,965	4,817	13,979	13,267	12,988	11,905	9,747	-14
41	14,443	13,785	13,329	12,773	10,940	5,848	14,068	13,462	13,290	12,533	10,676	-16
42	14,511	13,954	13,617	13,355	11,827	6,871	14,159	13,620	13,547	13,053	11,496	-35
43	14,542	14,068	13,844	13,839	12,602	7,895	14,224	13,739	13,803	13,469	12,202	-22
44	14,597	14,195	14,033	14,276	13,309	8,871	14,280	13,851	14,022	13,814	12,798
45	14,664	14,332	14,217	14,689	14,022	9,824	14,347	13,952	14,234	14,147	13,385	13

圖2：未經處理和去污的qPCR 2x預混液用于以5步分析10倍的大腸桿菌gDNA連續稀釋液。包括NTC樣品，連續稀釋的所有圖均顯示三個重復的平均值。

使用PCR Decontamination Kit進行處理不會降低PCR的敏感性。即使稀釋DNA，Cq水平也沒有明顯改變（圖2）。

套件內容

DTT（滅活援助）
dsDNase（100個反應）

儲存條件：儲存于-20?C。
樣品材料：該試劑盒可用于減少普通PCR和基于探針的qPCR混合物中的污染DNA。對于某些基于SYBR的qPCR混合物也很有效。
質量控制：已 對試劑盒中是否存在RNase進行了測試。

雙鏈特異性DNase

雙鏈特異性DNase（dsDNase）是*的雙鏈特異性核酸內切酶。由于它們不消化ssDNA或RNA，因此可用于在其他核酸存在下特異性去除dsDNA。該酶是熱不穩定的，因此使其成為必須使DNase失活的應用的理想選擇。該酶有兩種版本，dsDNase和HL-dsDNase。

不含甘油和Triton FREE的版本

dsDNase和HL-dsDNase現在可用

物產

對雙鏈DNA的
特異性已對雙鏈和單鏈DNA和RNA寡核苷酸測試了核酸特異性。

使用具有5'處FAM和3'（Eurogentec）的FAM的15-mer寡核苷酸測量了dsDNase對底物的特異性。熒光與酶活性成正比。

測定條件：25 mM Tris pH 7.5、5 mM MgCl 2和2μM寡核苷酸。

相對活動

基質	相對活動
雙鏈DNA	100％
單鏈DNA	<0.03％
雙鏈RNA	<0.01％
單鏈RNA	<0.01％

從上面的數據可以得出結論，dsDNase是雙鏈特異性的。

dsDNase

熱失活
dsDNase可以通過在65°C下15分鐘或60°C下20分鐘的熱處理進行熱滅活。該酶需要1 mM DTT和pH≥8才能*滅活。

技術指標

單位定義
一個單位定義為在100 mM醋酸鈉pH 5.0和5 mM MgCl2中使用50 µg / ml高分子量DNA在260 nm處的吸光度每分鐘增加0.001。
比
活Ca。400 000 Kunitz單位/毫克
活性
dsDNase在20-40°C的溫度范圍內具有很高的活性。它至少需要2.5 mM Mg的活性，并具有7.5的pH。
儲存緩沖液
20 mM Tris-HCl pH 7.5、2 mM MgCl2、10 mM NaCl，0.01％（v / v）Triton X-100、50％（v / v）甘油。
純度
dsDNase被純化至明顯的同質性。
儲存
-20°C時，小儲存期限為3年。在4°C下可以保存至少6個月。該酶還耐受多個凍融循環。

HL-dsDNase

熱失活
HL-dsDNase可通過在58°C下5分鐘的熱處理進行熱失活。該酶需要1 mM DTT和pH≥8才能*滅活。